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DEUNER, Carolina Cardoso. Inoculação artificial e detecção de Curtobacterium flaccumfaciens pv. flaccumfaciens em sementes de feijão. 2007. 120p. Tese (Doutorado em Agronomia ? Fitopatologia) ? Universidade Federal de Lavras, Lavras, MG.* Curtobacterium flaccumfaciens pv. flaccumfaciens (Cff), agente causal da murcha-de-curtobacterium, foi relatado pela primeira vez, no Brasil, em 1995. Apesar de relativamente novo no país, o patógeno está disseminado pelas principais regiões produtoras de feijão, causando grandes prejuízos econômicos. As sementes constituem a sua principal forma de sobrevivência e disseminação. Portanto, o presente trabalho teve como objetivos desenvolver uma técnica eficiente de inoculação, baseada no condicionamento fisiológico do meio, e de detecção, utilizando-se a PCR, de Cff em sementes de feijão, para uso em pesquisas e em laboratórios de análise fitossanitária de sementes. Para o desenvolvimento da técnica de inoculação artificial utilizou-se o condicionamento fisiológico em substrato agarizado. Testaram-se quatro substratos (meio 523, meio 523+KCl, meio 523+manitol e meio 523+sacarose), quatro potenciais hídricos (-0,55, -0,75, -0,95 e -1,15 MPa) e cinco tempos de exposição da semente ao meio 523 (24, 48, 72, 96 e 120 horas). A inoculação artificial consistiu na exposição das sementes de feijão, por 48 horas, ao isolado de Cff, proveniente do estado de Santa Catarina (Cff SC - Feij-2928), no meio 523 com o restritor hídrico manitol no potencial hídrico de -0,95 MPa. Esse tratamento foi o que menos afetou a percentagem de germinação das sementes após o condicionamento fisiológico. Para a otimização da técnica de PCR, foram comparados dois pares de primers descritos na literatura para a detecção dessa bactéria. Um foi desenvolvido a partir de biblioteca cromossomal, construído em plamídeo (CF4-CF5) e o outro a partir do fragmento amplificado via PCR baseado na seqüência repetitiva (Rep-PCR) (CffFOR2-REV4). O par de primers CffFOR2-REV4 demonstrou maior repetibilidade e eficiência na detecção de Cff em sementes de feijão. Foram testados também quatro métodos de preparação do extrato de sementes para a obtenção do DNA de Cff a ser utilizado na PCR: extrato bruto, obtido diretamente das sementes; extrato concentrado em membrana milipore; extrato concentrado por centrifugação e extrato plaqueado em meio seletivo (BioPCR). Dentre esses métodos, tanto a Bio-PCR quanto o extrato concentrado por centrifugação, seja no volume de 20 ou 80 mL, amplificaram segmento de DNA de 306 pb, característico da presença de Cff. Essas duas técnicas apresentam boa sensibilidade, permitindo a detecção de até uma semente contaminada com Cff, em 999 sementes sadias. Portanto, foi possível desenvolver uma técnica rápida, sensível, confiável e de fácil execução para a detecção de Cff em sementes de feijão, constituindo-se em metodologia potencial para uso rotineiro em laboratórios de análise fitossanitária de sementes.
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